• 重大突破

    蘇州醫工所周連群團隊在芯片式數字PCR檢測技術和儀器研制方面取得系列進展

      核酸檢測逐漸成為病原體診斷的“金標準”,隨著新型冠狀病毒疫情的持續蔓延,核酸檢測的重要性正不斷被大眾認知和認可。作為高靈敏度、絕對定量、高耐受性的新一代核酸檢測技術,數字化聚合酶鏈式反應(數字PCR,dPCR),在稀有突變檢測、拷貝數變異檢測、液體活檢、單細胞分析、轉基因檢測、病毒載量檢測、微生物定量分析、NGS文庫制備等應用領域發揮著重要作用。 

      蘇州醫工所周連群課題組聚焦生物傳感器領域,深耕十余年,在生物傳感方法開發、生物芯片設計加工、生命科學儀器研制等方面積累了堅實基礎。在數字PCR研發方面,基于隔離穩定性高、溫度均勻性好、檢測速度快的芯片式數字PCRcdPCR)方法,自主研發了高通量數字化芯片及高通量數字化核酸分析儀,圍繞高通量數字化核酸檢測方法、芯片、試劑和儀器等方面取得了一系列重要進展。 

      在高通量數字化芯片的加工與改性方面,周連群課題組的李金澤、邱亞軍等人在Analyst上發表題為Heterogeneous modification of through-hole microwell chips for ultralow cross-contamination digital polymerase chain reaction的論文,提出了針對數字化芯片三維異質性改性的新策略,通過內壁親水、表面疏水的異質性化學改性,實現了高填孔率、低殘留的數字化樣品分割。通過深硅刻蝕可以得到高密度蜂窩狀微孔陣列,如何保證待測生物樣本能高效的填充入微孔,并且降低液體在表面殘留導致的孔間連通,是數字化樣品分割的關鍵。針對該問題科研人員提出了對于均質硅材料的三維異質性改性策略,即通過微接觸印刷只在特定的空間位置發生化學修飾,進而在均質材料的三維空間上形成具有不同化學性質的界面。通過工藝優化消除了樣本揮發導致的擴散效應,實現了芯片表面的選擇性疏水修飾。三維異質性改性后的芯片可以達到91%以上的填孔率以及小于5%的液體殘留率,優于商業化的數字PCR芯片。利用該芯片可以實現高效準確的dPCR檢測,定量結果的線性相關性達到0.999以上。該核心技術的突破為自研cdPCR的精準定量奠定了堅實基礎。 

     1 高通量數字化核酸檢測芯片的三維異質性改性效果圖 

      在樣本的數字化分配與封裝方面,周連群課題組的高旭等人在Biomicrofluidics上發表題為High filling rate digital PCR through-hole array chip with double independent S-shaped flow channels的論文,提出了針對數字化芯片的微流控進樣封裝方法,通過雙S型流道夾心數字化芯片的結構,有效提高的樣品的填孔率和裝載重復性。傳統的刷樣方式,受限于操作的繁瑣性,存在耗時長、重復性差、易污染的問題,限制了芯片式數字PCR的應用。通過微流控結合標準化儀器設備,可以實現進樣封裝的標準化和自動化,簡化用戶的手動操作步驟和整體樣品裝載和封裝時間。本文主要通過流體力學仿真結合試驗驗證,解決了流體樣本與微孔相互作用過程中的穩定性、均勻性和重復性問題,通過合理的結構設計和優化的進樣條件,實現了填孔率大于99%、填孔液體體積CV6%的高效、高均勻性進樣與封裝。該成果的突破有效提升了自研cdPCR的易用性,為產品的臨床應用推廣奠定了良好基礎。 

     2 數字化芯片的微流控進樣封裝結構:(a)結構裝配圖;(b)結構爆炸圖 

      在芯片式數字化核酸檢測的應用方面,周連群課題組與華山醫院檢驗醫學科關明課題組合作在Sensors & Actuators: B. Chemical(中科院I區)上聯合發表題為Establishment of scalable nanoliter digital LAMP technology for the quantitative detection of multiple myeloproliferative neoplasm molecular markers的論文,對骨髓增殖性腫瘤(MPN)的多重標志物實現了超敏、多靶標、定量檢測,從而為這種罕見病的早期診斷和靶向治療提供新的方法。Ph染色體(費城染色體)陰性的經典骨髓增殖性腫瘤是以一系或多系分化相對成熟的骨髓造血干細胞持續克隆性增殖為特征的惡性血液疾病。隨著分子生物學技術的迅速發展,越來越多的分子標志物被不斷發現。根據世界衛生組織(WHO)最新的骨髓增殖性腫瘤診斷標準,JAK2、MPL CALR三個基因的突變已被作為骨髓增殖性腫瘤診斷的重要參考指標。周連群研究員課題組與關明教授課題組“醫-工”結合,將環介導等溫擴增(LAMP)技術快速等溫擴增的優勢、微流控技術高通量的優勢和數字PCR技術準確定量的優勢進行整合,成功開發了一款數字LAMP檢測平臺,并基于納米粒子的特殊功能,對現有的LAMP檢測體系進行了改良,可在60分鐘內實現骨髓增殖性腫瘤CALR-1、CALR-2JAK2 V617F分子標志物的準確定量檢測,檢測靈敏度分別為0.5%、0.1%0.5%突變水平。與現有的商業化數字PCR平臺相比,本項目開發的數字LAMP平臺具有檢測成本低、檢測速度快等優勢,具有良好的應用前景。論文的第一作者為曹國君博士和李金澤博士。 

     3 多靶標數字LAMP檢測平臺檢測流程示意圖 

      芯片式數字PCR的研發工作得到了國家自然科學基金委、中國科學院項目的支持,形成了高耐受高擴增效率試劑(CN201811098669.3)、三維異質性改性(CN201810568211.3)、進樣封裝一體化(CN201910377557.X)、物理分區式多靶標檢測(CN201710560138.0)、均勻快速熱循環(CN201910911821.3)、高分辨率多色熒光成像(CN201910049908.4)、自適應圖像處理算法(CN201910600118.0)等一系列核心技術,實現了方法、芯片、試劑和儀器的全鏈條自主知識產權創新。相關儀器入選《中國科學院自主研制科學儀器2021》目錄,并完成了二類醫療器械的型式檢驗,進入醫療器械注冊證申報流程;已經在華山醫院、北京基因組所等多家醫院、科研院所等單位開展了應用示范。 

     4 芯片式高通量數字化核酸分析芯片及儀器

      論文鏈接: 

      [1] Jinze Li#, Yajun Qiu#, Zhiqi Zhang, Chuanyu Li, Shuli Li, Wei Zhang, Zhen Guo, Jia Yao, Lianqun Zhou*. Heterogeneous modification of through-hole microwell chips for ultralow cross-contamination digital polymerase chain reaction. Analyst, 145 (2020), 3116-3124. https://doi.org/10.1039/D0AN00220H 

      [2] Xu Gao#, Jinze Li, Chuanyu Li, Zhiqi Zhang, Wei Zhang, Jia Yao, Ming Guan, Zhen Guo, Chao Li, Lianqun Zhou*, High filling rate digital PCR through-hole array chip with double independent S-shaped flow channels. Biomicrofluidics 14 (2020), 034109. https://doi.org/10.1063/5.0006374 

      [3] Guojun Cao#, Jinze Li#, Zhifang Xing, Zhiqi Zhang, Wei Zhang, Chuanyu Li, Longhui Li, Zhen Guo, Shuli Li, Xu Gao, Yanchun Ma, Lianqun Zhou*, Ming Guan*. Establishment of scalable nanoliter digital LAMP technology for the quantitative detection of multiple myeloproliferative neoplasm molecular markers. Sensors & Actuators: B. Chemical 346 (2021) 130493. https://doi.org/10.1016/j.snb.2021.130493 

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